③酵素的酸度 尿素一般选用的酸度为0.1%-0.25%（气息1:200或1:250），但遇到难咀嚼的的第三组织时，酸度可合理减少，咀嚼星期合理延长。酸度高对细胞内有致癌性，而较高酸度的尿素在指导盐酸当中可促进细胞内的抑制，若指导盐酸当中转到血液，其少量尿素可被血液当中抗尿素系数所清除。
④辛度 一般认为尿素在56℃时活性最强，但由于对细胞内有危害而没律被选用，故常故常用的辛度为37℃，通故常在37℃顺利完成咀嚼比寝室辛功用快。
⑤pH pH8~pH9是尿素气息较难范围，但随碱性的增加其气息也骤然减少，活性强集当中快，细胞内也容需注意被咀嚼下来，咀嚼复合细胞内时PH只能选用7.6~8.0之两者彼此间，否则对细胞内有危害。
⑥无机盐阳离子 若用含有铁质和锰的盐类溶盐酸来盐酸尿素时，可以时有发生抑制大肠细胞内的咀嚼功用。因此，在盐酸时应选用无铁质锰阳离子的PBS盐酸。
⑦咀嚼星期 如果细胞内咀嚼星期较长，可以危害细胞内的排尿酵素，从而因素细胞内的糖类，一般咀嚼星期为20分钟为宜，的水咀嚼时故常用低酸度水会，于4℃过夜也可。
复合作律如下：
①过夜的水咀嚼 将夺得的的第三组织用Hanks盐酸洗三次，剪成整块不等为4毫米左右，用Hanks盐酸洗2~3次以除去血球和脂肪的第三组织，便转到0.25%的尿素，摇匀后放4℃过夜，次日便用Hanks盐酸浇，弃去上清，共洗2~3次，然后，转到少量营养盐酸吹打集当中，细胞内计数，按合理的酸度分瓶指导。
②多次分离出来咀嚼律 多次分离出来咀嚼律有以下三种：
微咀嚼多次分离出来；还有将剪碎的细胞内块转到0.25%尿素37℃水浴当中咀嚼15~20分钟，然后经浇并用营养盐酸集当中作成细胞内悬盐酸，按合适的酸度分瓶指导，然后将留下的并未彻底咀嚼的的第三组织按上述作律操作作律，便咀嚼分离出来细胞内。
的水咀嚼多次分离出来；还有作律同上，只是咀嚼辛度为4℃。
先微咀嚼后的水咀嚼；还有将的第三组织块先用尿素于37℃下咀嚼20分钟经浇并用营养盐酸集当中，作成悬盐酸，剩余并未咀嚼的小的第三组织块经浇并用大肠酵素于4℃下过夜，次日便分离出来细胞内，集当中成悬盐酸，分瓶指导。
（2） 胶原酵素（Collagenase）咀嚼律
胶原酵素是一种从细菌当中分离出来出来的酵素，对胶原有过强的咀嚼功用。不利于咀嚼织物性的第三组织、结缔组织的第三组织以及癌的第三组织，它对细胞内两者彼此间质有较好的咀嚼功用，对细胞内本身因素不大，可使细胞内与胶原成分重归而不受伤害。该酵素复合敏感度好，即使有铁质、锰阳离子假定仍有活性，故一般来说PBS和含血液的指导盐酸盐酸，即操作作律简便又可减少细胞内成活率，最终酸度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此酵素咀嚼功用加剧，无须要机械设备周期性，但胶原酵素价格比较差，大量故常用将增加实验成本。
经过胶原酵素咀嚼后的结缔组织的第三组织，由于结缔组织细胞内对酵素有耐受性，有可能有一些结缔组织细胞内经年累月亦然并未被实质上咀嚼开。成小经年累月的结缔组织细胞内比集当中的单个结缔组织细胞内更需注意土壤，因此不必要便进一步咀嚼处理。
鉴于尿素和胶原酵素的生功用学活性（见表4-1）和在多种不同酸度下咀嚼各种的第三组织切割所须要的星期（同一时两者彼此间）有相似之处（见表4-2），以及两者价格比不等，有人选用胶原酵素与尿素并用，同时还可加类似物酵素（对细胞内凹凸不平色氨酸有功用），选用两者的牵头咀嚼功用，对集当中大鼠和兔肠胃、癌的第三组织并不有效。
表4-1 尿素和胶原酵素生功用活性的差别
项 总目尿素胶原酵素咀嚼功能性仅限于于咀嚼软的第三组织仅限于于咀嚼织物多的的第三组织用 量0.01%~0.5%0.1~0.3mg/mL（200u/mL）咀嚼星期 0.5~2同一时两者彼此间（切割）1~12同一时两者彼此间pH 8~96.5~7.0功用强度强力加剧细胞内因素星期较长有因素无大因素血液、铁质、锰阳离子有因素无因素表4-2 尿素和胶原酵素在多种不同辛度下咀嚼各种的第三组织切割时所须要星期（同一时两者彼此间）（0.5~1cm3）
酵素 种 类 较 较硬 第三组 织软 第三组 织4℃ 寝室 辛 37℃ 4℃ 寝室 辛 37℃尿素（0.25%）24~481~61~212~24 1~20.5~1胶原酵素（200u/mL） 2466.51230.25两者牵头（对冲）12~4612~244~1212~246~121~2除上述两种最特指的咀嚼酵素外，还有链霉细胞内酵素、垫细胞内酵素、蜗牛酵素、弹性细胞内酵素、木瓜细胞内酵素，近年来，还有一种从紫杆菌当中分离出来的Pronase新酵素集当中细胞内更佳。
2、非酵素咀嚼律（EDTA咀嚼律）
EDTA是一种非酵素咀嚼功用，又称螯合剂或Versene,全名为乙烯二胺四乙酸。特指不含铁质、锰阳离子的PBS配成0.02%的工作盐酸，对一些的第三组织，尤其是结缔组织的第三组织集当中敏感度好，该化学功用质能与细胞内上的铁质、锰阳离子结合形成螯合功用，利用结合后的机械设备力使细胞内变圆而集当中细胞内或使贴壁细胞内从瓶壁上重归，局限性是细胞内需注意氢化或贴壁细胞内从瓶壁上重归时排列成片状，有经年累月，故常不分开故常用，但可与尿素复合故常用（1:1或2:1），不仅利于细胞内脱壁又利于细胞内集当中，可降低大肠酵素的供应量和致癌性功用。
咀嚼复合律的操作作律步骤：
（1）剪切 把的第三组织块剪碎，排列成1~5mm3不等的的第三组织块。
（2） 加盐酸漂洗 将碎的第三组织块在平皿（或三角烧瓶）当中用无铁质锰PBS洗2-3次（选用抬升，人为塌陷律）。
（3）咀嚼 转到水会（尿素或胶原酵素或EDTA）于37℃水浴当中功用合理星期（当中两者彼此间可轻摇1~2次），若的第三组织块膨松排列成絮状可终止，若叠加不大可换成一次水会，继续咀嚼直至膨松絮状为止。尿素咀嚼星期不宜较长。
（4）弃去水会 选用抬升人为塌陷或可控离心律适度弃去水会。
（5）漂洗 将含有铁质、锰阳离子的指导基沿瓶壁向上转到，当中止咀嚼加成，选用漂洗律洗2-3次后，转到实质上指导基。
（6）机械设备集当中 选用滴管吹打或周期性律，使细胞内充分移去并用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶指导，若要求不高可选用抬升人为塌陷5~10分钟，滴上层细胞内悬盐酸顺利完成分瓶指导。
注意事项如下：
（1）的第三组织块不能漂洗2-3次以除去的第三组织当中的铁质、锰阳离子和血液对尿素和EDTA的抑制功用。
（2）大肠细胞内酸度不宜过高，功用星期没律太长，以不必要致癌性功用。
（3）咀嚼后的第三组织不仅要适度弃去水会，以不必要致癌性产生，而且手势要轻，以不必要膨松的细胞内随漂洗而丢弃。
三、原代细胞内的指导作律
原代细胞内的指导也叫十代指导 是从诱导夺得的第三组织细胞内在体外顺利完成的首次指导，是建立细胞内系的第一步，是一项基本技术。原代细胞内因刚从的第三组织当中复合开，生功用学功能性并未时有发生不小叠加，仍保留原来的遗传功能性，也最相对于和反映体内土壤功能性，较难用于药功用敏感度实验、细胞内分化等实验研究。
原代细胞内经故常有多种细胞内第三组成，比较相异，即使从形态上为同一类型（结缔组织样或成织物样），但细胞内两者彼此间仍有不小相似之处。如果诱导多种不同，即使的第三组织类型、口部不同，个体相似之处也照样假定，原代细胞内生功用功能性亦然不稳定，如须要认真相当恰当的对比性实验研究，还须要顺利完成短期传代指导。
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